首页 >  硕士论文 > 农学硕士论文 >   正文

鸡烟曲霉菌的分离及定量PCR农学检测方法的建立

添加时间:2018-07-11 19:18:17   浏览:次   作者: www.dxlwwang.com
专业论文资料, 搜索论文发表论文代写论文网为你解忧愁!详情请咨询我们客服。
获取免费的论文资料? 欢迎您,提交你的论文要求,获取免费的帮助

本文是一篇农学硕士论文,农学:包括作物学、园艺学、农业资源利用、植物保护学、畜牧学、兽医学、林学、水产学等8个一级学科,共有27个二级学科。(以上内容来自百度百科)今天为大家推荐一篇农学硕士论文,供大家参考。

 
第一章 鸡烟曲霉菌的研究进展
 
1.1 鸡烟曲霉菌病的概述
鸡曲霉菌病是由各种曲霉菌定居、繁殖于禽类体内所引起的疾病[1,2]。多种禽类均可感染[3],包括笼养鸡、火鸡、水禽、野鸟、鸨、动物园中的鸟以及笼养鸟等。本病在世界各国广泛流行,各种年龄的禽类均可感染,尤其对雏鸡和育成鸡生产影响最大[4,5]。曲霉菌包括烟曲霉菌(A.fumigatus)、黄曲霉菌(A.flavus)、土曲霉(A.terreus)、黑曲霉(A.niger)、灰绿曲霉(A.glaucus)、白曲霉(A.candidus)等[6]。其中烟曲霉菌是曲霉菌病的主要致病菌。在曲霉所引起的系统性感染中,90%是由烟曲霉引起的[7]。1863 年,Fresenius 第一次从鸨肺中分离到烟曲霉菌。烟曲霉可产生大量分生孢子(每个分生孢子头可产生成千孢子)[8]。孢子以 2-3μm 的直径释放到空气中,不需任何特殊的机制,仅仅靠环境和气流传播。分生孢子抵抗力较强,可在多种环境条件下广泛存在[9,10,11]。烟曲霉孢子通过吸入或食入感染,感染鸡主要表现为食欲减退、呼吸次数增加、张口喘气,有精神沉郁、羽毛松乱、翅膀下垂等症状[12,13]。典型病变特征:肺和气囊上有米粒到绿豆大小的黄白色或灰白色坏死性结节,触之有弹性,切开可见内容物为干酪样,内含丝绒状菌丝体[14]。病程较长时,弹性消失,触之较硬。气囊膜变厚、浑浊[15]。此病发生与平时的饲养管理和环境有着密切的关系,如饲料变质发霉、育雏舍及孵化器被污染、垫料污染、通风不佳等,均可促进烟曲霉菌病的发生和流行[16,17],使它成为(除白色念珠菌外)最常见的致病真菌[18]。曲霉菌病是人畜共患传染病[19]。不仅对禽类造成感染,降低饲养效率,影响产品质量;而且会对人体造成感染,侵害多种器官,尤其肺部,其他部位包括气管、支气管、鼻窦等[20,21],对人体健康造成严重,甚至致命的威胁。人类曲霉菌病中 90%-95%是由烟曲霉引起的,给公共卫生带来严重的后果[22]。人体感染的方式分为两种:原发性感染和条件性感染。原发性感染患者无基础疾病或免疫缺陷,多为吸入大量被曲霉污染的物质所致,较少见。条件性感染患者常患有骨髓移植、血液恶性肿瘤、实体器官移植、艾滋病(AIDS)等疾病[23]。李莎莎对宁夏某医院曲霉菌病进行调查,烟曲霉菌病占 90.6%[16]。
...........
 
1.2 曲霉菌病流行病学调查
在国内,李景丽报道鸡曲霉菌病呈急性爆发,发病率为 70%以上,死亡率约为 50%。李英[15]对某鸡场进行了报道,其发病率为 35%,死亡率为 25%。温玉玲报道的荣昌某鸡场的发病率为 80%,死亡率为 30%。孙桂芹报道鸡曲霉菌病雏鸡的死亡率为 10%-50%,成年鸡为散发,杨为敏也有同样的报道。李君和杜萍调查发现人曲霉菌病的感染明显增多,其病死率为 56%-85.1%[24,25]。王宏等报道人侵袭性真菌病的死亡率为 38%-85%[26]。施毅对北京协和医院、南京军区总医院以及国内一项大规模调查分析后发现,烟曲霉菌是最常见的病原菌之一,占比 31%-39.5%。并且其感染比例呈现上升趋势[30]。在国外,Joseph 报道在美国内布拉斯加州公园乌鸦曲霉菌病的死亡率为 10%。Pascal Arne 报道曲霉菌病的发病率在 4.5%-90%,发病日龄在 3 d-20 w。美国衣阿华州某鸡场 13-18w 的鸡群中,烟曲霉菌病年发病率为 8.3%[27]。William 报道在免疫功能受损人群中,侵袭性曲霉菌病的感染率最可高达 50%,死亡率一般为 50%。Mayer 等报道在意大利 1999-2003 年调查了 11802 个病人,有38 名(4.6%)病人被诊断为侵袭性曲霉菌病,而其中 373 人(69%)为烟曲霉菌感染,烟曲霉菌病导致的死亡率为 60%-70%[28]。Sanglard 指出造血干细胞移植的患者曲霉菌病的感染率约为 50%,死亡率为 30%-50%。Hardak 对临床医院内 107名血液恶性肿瘤的病人进行调查,曲霉菌病的发病率为 60%-90%。
.........
 
第二章 鸡真菌病的流行病学调查
 
由于曲霉菌种类繁多,抗原复杂导致抗体水平不规则;又由于免疫抑制病的影响,机体不仅细胞免疫低下,而且体液免疫也受到抑制,甚至无法对入侵真菌产生抗体,导致无法从抗体水平角度调查。因此从(1,3)-β-D-葡聚糖(BDG)和半乳甘露聚糖为主的抗原水平调查真菌病的方式越来越受到关注。G 试验主要检测血液中(1,3)-β-D-葡聚糖(BDG)成分,此成分主要存在于曲霉属、念珠菌属、毛孢子菌、镰刀菌、枝顶孢属、组织胞浆菌等多种真菌中。GM 试验为第一个用于检测侵袭性烟曲霉菌的抗原[65]的检测方法,半乳甘露聚糖(GM)是一种多糖,存在于多种真菌如曲霉菌和青霉菌细胞壁成分中。侵袭性曲霉菌感染的早期释放进入血液循环,适用于侵袭性真菌感染早期的诊断。近年来,真菌病的发生有增加的趋势[106]。综合国内外对曲霉菌病的报道,人曲霉菌病的发病率为 4.6%-50%,死亡率为 50%-70%。动物曲霉菌病的发病率在4.5%-90%,死亡率为 10%-85%。而目前鸡烟曲霉病的诊断主要根据临床症状和解剖变化,是通过解剖个别鸡对群体发病情况的推测,不是对每个个体进行发病情况调查,统计数据不准确,致使发病率和死亡率数据出现偏差。因此本试验通过检测(1,3)-β-D-葡聚糖和半乳甘露聚糖水平对临床鸡场真菌病流行病学进行调查。
 
2.1 结果
共采集鸡血清 287 份,每个季节 G 试验和 GM 试验的阳性率汇总如下:G 试验阳性率结果(表 2-2&图 2-1):总阳性率为 16.0%(46/287),其中春季阳性率为 12.0%、夏季为 28.6%、秋季为 12.8%、冬季为 12.5%;夏季阳性率最高,其次为秋季、春季、冬季。GM 试验阳性率结果(表 2-3&2-2):总阳性率为 15.3%(44/287),其中春季为 12.7%、夏季为 27.0%、秋季为 11.5%、冬季为 10.8%。夏季阳性率最高,其次为春季、秋季、冬季。
.......
 
2.2 讨论
G 试验和 GM 试验逐渐受到国内外学者的关注,但大多用于人医,且取得了不错的效果。2003 年被欧美多个国家列为诊断侵袭性真菌病的微生物学标准之一[52],并被用于血液、肿瘤等免疫受损者侵袭性真菌感染的诊断[50,53,54]。我国 2007年重症医学会推荐的治疗指南也将血清(1,3)-β-D-葡聚糖和半乳甘露聚糖检测作为侵袭性真菌感染的依据之一[55]。目前临床上鸡真菌病的诊断主要根据临床症状和解剖变化,是通过解剖个别鸡对群体发病情况的推测,不是对每个个体进行发病情况调查,统计数据不准确,致使感染率、发病率和死亡率数据出现偏差。但国内还未见有人报道对鸡真菌病感染率的调查。因此本试验从临床采集鸡血清样本 287 份,对其抗原水平进行调查。G 试验结果显示,鸡真菌病感染率为 16.0%;GM 试验结果显示,鸡真菌病感染率为 15.3%。综合 G 试验和 GM 试验结果发现,夏季的阳性率明显高于其他三个季节,且其他三个季节无较大差异,表明夏季为鸡真菌病主要流行季节。原因可能有以下两点:1)真菌气溶胶的影响,鸡舍内真菌气溶胶是畜禽舍内重要组成部分,更易进入机体体内,对动物造成较大影响。2)季节影响,根据白福娟[105]对不同季节鸡舍内真菌气溶胶浓度的调查结果,真菌气溶胶受到季节影响,且其浓度在夏季最高。
........
 
第三章 鸡烟曲霉菌的分离鉴定和分型........14
3.1 材料和方法........14
3.2 结果........19
3.3 讨论........30
3.4 小结........32
第四章 鸡烟曲霉 SYBR Green I 荧光定量 PCR 方法的建立.........33
4.1 材料与方法........33
4.2 结果........35
4.3 讨论........38
4.4 小结........39
第五章 鸡烟曲霉菌和白色念珠菌 SYBR Green I 双重荧光定量 PCR 方法的建立........41
5.1 材料与方法........41
5.1.1 材料.............41
5.1.2 方法.............41
5.2 结果与分析........42
5.3 讨论........46
5.4 小结........47
 
第六章 试剂盒的组装及应用
 
6.1 材料
所用材料与建立鸡白色念珠菌和鸡烟曲霉 SYBR Green Ⅰ 双重荧光定量 PCR检测方法所用材料一致。A 液:PCR 扩增缓冲液(2×One Step PCR Buffer III 10 μL;TaKaRa Ex TaqHS(5U/ μL)0.4 μL;Primecript Enzyme Mix II 0.4 μL 特异引物白色念珠菌和烟曲霉终浓度均为 0.6μM)B 液:峰 2+ZU2-2 模板,作为阳性对照;C 液:ddH2O 作为阴性对照。具体操作方法为:取待检真菌 DNA 和 A 液加入到反应管中作为待检样品,取B 液和 A 液加入到反应管中作为阳性对照,取 C 液和 A 液加入到反应管中作为阴性对照。
\
.......
 
结论
 
1. 通过对检测临床鸡场的鸡血清(1,3)-β-D-葡聚糖和半乳甘露聚糖含量发现,鸡曲霉菌病感染率为 12.0-28.6%,且随季节而变化。
2. 通过形态学观察结合 rDNA-ITS 基因测序将本试验分离的 7 株分离株鉴定为烟曲霉并基于 CSP 基因,按照国际标准化命名将其分为 t04A 型、t09c型、t18b型、和 t22b型 4 种基因型。用 t09c型分离株对雏鸡进行攻毒试验,制作常规石蜡切片,通过雏鸡临床特征、病理结构及菌丝孢子的形态特征得出结论:空气中的烟曲霉菌与鸡体致病存在联系。
3. 建立了检测鸡烟曲霉菌的 SYBR Green I 荧光定量 PCR 方法,快速;特异;敏感性,最低检测下限为 3.76×101CFU/mL;稳定性好,变异系数均小于 1%。建立了可同时检测鸡烟曲霉菌和白色念珠菌的 SYBR Green I 双重光定量 PCR 方法,快速;特异;敏感性,最低检测下限分别为为 3.76×101CFU/mL 4.34×101CFU/mL;稳定性好,变异系数均小于 1%。并成功组装了用于检测鸡烟曲霉菌和白色念珠菌的试剂盒,便于临床检测。
..........
参考文献(略)

提供海量毕业论文,论文格式,论文格式范文,留学生论文,商务报告相关资料检索服务。
本论文由代写论文网整理提供 http://www.dxlwwang.com/
需要专业的学术论文资料,请联系我们客服
本文地址:http://www.dxlwwang.com/nongxue/6751.html
论文关键字:农学硕士论文 烟曲霉菌