首页 >  硕士论文 > 农学硕士论文 >   正文

基于LLO单核细胞增多性李斯特菌弱毒株疫苗载体的农学构建

添加时间:2018-07-23 19:20:26   浏览:次   作者: www.dxlwwang.com
专业论文资料, 搜索论文发表论文代写论文网为你解忧愁!详情请咨询我们客服。
获取免费的论文资料? 欢迎您,提交你的论文要求,获取免费的帮助

本文是一篇农学硕士论文,农学专业培养具备作物生产、作物遗传育种以及种子生产与经营管理等方面的基本理论、基本知识和基本技能,能在农业及其它相关的部门或单位从事与农学有关的技术与设计、推广与开发、经营与管理、教学与科研等工作的高级科学技术人才。(以上内容来自百度百科)今天为大家推荐一篇农学硕士论文,供大家参考。

 
第一部分文 献 综 述
 
1 李斯特菌概述
单核细胞增多性李斯特菌是李斯特菌病主要致病因子,最容易感染老年人,免疫功能低下者和孕妇[1]。虽然这是一种不常见食源性疾病,可是一旦发病往往需要住院治疗[2,3],死亡率高达 20~30%[4]。疾病预防控制中心(CDC)和《患病率和死亡率周报》指出,在 2013 年发生的 123 个病例中,91%的病例接受了住院治疗[5]。该病感染后可能会出现败血病、脑膜炎和肠胃炎症状[6],在感染孕妇中,可能会引起自然流产,早产和新生儿疾病。在这些病例中,大多数是由血清型 1/2a(谱系 II)、1/2b 和 4b(谱系 I)造成[1,7,8]。谱系 I 主要造成人类临床李斯特菌病的暴发;而谱系 II 在食物分离物,环境和动物临床病例中表现出显著的流行性[9];谱系 III 和 IV 菌株在人类中约占李斯特氏菌病的 1%,但在动物中发病较多[10]。大多数散发性李斯特菌病病例几乎是由 4b 和 1/2a 血清型菌株引起,其中大多数人类李斯特菌病暴发与 4b 血清型菌株相关,而非 4b 血清型菌株很少发生疫情,但也有报道过[11]。例如,美国暴发过与切片火鸡有关的肠炎性李斯特菌病的血清型就为 1/2a。在美国,对食物中的单增李斯特菌有一个零容忍政策,任何掺假疑似感染食品都必须要召回[3]。据调查结果显示,美国多起李斯特菌病暴发与受污染的哈密瓜,奶酪,火鸡熟肉,冰淇淋,未经高温灭菌的牛奶,包装和冷冻蔬菜有关,生奶奶酪也受其污染[12]。近年来,李斯特菌已经被应用于疫苗载体研究表达各种免疫蛋白来启动细胞免疫。AbiAbdallah[13]用李斯特菌的弱毒株作为沙蝇唾液蛋白 LIM11 的疫苗表达系统来预防利什曼病。Singh, M[14]用李斯特菌的弱毒株表达肿瘤相关抗原蛋白Mage-b 有效地治疗了转移性乳腺癌。YuYang[15]将李斯特菌弱毒株作为肝肿瘤干细胞生物标记的 CD24 的疫苗载体,明显减小了肿瘤的大小,延长了小鼠的寿命。单增李斯特菌的第二个优点是有强大的分选酶系统。这种系统普遍存在于革兰氏阳性菌中,而且已经在葡萄球菌、乳酸链球菌、炭疽杆菌和李斯特菌等中都已经得到了应用。分选酶最早是在金黄色葡萄球菌中发现的一种蛋白水解酶,并被命名为 SrtA。SrtA 识别 C 端的分选基序 LPXTG,并在 T-G 之间切割肽键,将表面蛋白 C 末端的苏氨酸残基连接到肽聚糖前体上,然后将表面蛋白 T 残基之前的多肽转给肽聚糖并与之共价结合形成成熟的表面蛋白[16]。Nguyen 和 Schumann[17]将李斯特菌中识别分选信号 LPXTG 基序的 SrtA 分选酶编码基因转入枯草芽孢杆菌,然后将 α-淀粉酶基因与金黄色葡萄球菌的 fibronectin binding protein B(FnBPB)的 C 端分选信号编码区融合,转入枯草芽孢杆菌,细胞表面展示了高达 240000 分子的 α-淀粉酶。
........
 
2 单增李斯特菌的感染机制
单增李斯特菌感染机体并引发疾病是因为它能够轻易穿过宿主胃肠道屏障、胎盘屏障以及血脑屏障,从而使机体表现出胃肠炎、流产和脑膜炎等李斯特菌病症状[18]。李斯特菌感染宿主主要包括以下几个过程[19](图 1):(1)黏附与侵袭:单增李斯特菌表面蛋白内化素 A 和 B(InlA 和 InlB)分别能够与宿主细胞表面受体 E-钙粘蛋白(E-cadherin)和肝细胞生长因子(Met)结合,并通过“拉链机制”黏附侵入细胞内;(2)逃逸吞噬体:细菌通过内化途径侵入细胞后首先被困于单层膜的吞噬体(初级吞噬体)内,接着细菌在溶血素 O(LLO)以及磷脂酶A 和 B(PlcA 和 PlcB)的作用下将吞噬体膜裂解进而从吞噬体内逃逸出来进入细胞质,细菌能够摄取并利用胞质内的营养物质完成自身的复制与增殖;(3)细胞间扩散:一旦逃逸进入胞质后,细菌通过表面蛋白 ActA 介导的方式招募并聚合宿主肌动蛋白在细菌的一端形成彗星样尾巴,然后在内化素 C(InlC)的介导下推动细菌借助细胞膜突起形式迁移至邻近细胞中从而完成一次完整的感染过程;(4)新一轮感染:与首轮感染唯一不同的是,细菌迁移进入邻近细胞后是被包裹于双层膜的吞噬体(次级吞噬体)中,之后将以同样的方式开始新一轮的感染。在整个胞内感染过程中,单增李斯特菌始终未暴露于细胞外,从而能够逃避宿主免疫系统的干扰和清除[20, 21]。
..........
 
第二部分试 验 研 究
 
第一章 单增李斯特菌溶血素 LLO 蛋白关键氨基酸位点研究
近年来,利用表面展示系统将靶蛋白展示在细胞表面已经得到了广泛的应用。E.-J.KIM 和 S.-K.YOO 在大肠杆菌中将乙型肝炎病毒(HBsAg)的表面抗原和丁香假单胞菌的外膜蛋白冰核蛋白(INP)融合表达,利用 INP 可以锚定到细胞表面的特性构建了一种大肠杆菌的表面展示系统,为乙型肝炎疫苗的制备奠定了很好的基础[80]。有学者将一株分离的乳酸乳球菌中扩增表达的 AcmA 作为运载蛋白, 利用 GFP 作为报告蛋白, 构建了 1 株可在其细胞表面展示 GFP 的重组展示工程菌,并对工程菌细胞表面展示蛋白的定位与展示性能进行了分析。李斯特菌也已经被应用于疫苗载体研究表达各种免疫蛋白来启动细胞免疫。EGDe 菌株是一种强毒力的胞内寄生菌,若要将其应用于抗原递呈和抗病毒免疫,需要构建一种弱毒株,同时若要实现表面展示系统的构建,需要分选酶识别 LPXTG 基序,将蛋白锚定到细胞表面。单增李斯特菌中最主要的毒力基因LLO 缺失后,李斯特菌毒力显著下降,经过分析 LLO 本身没有 LPXTG 基序,但是将其第 472-483 位这 12 个氨基酸缺失之后可以形成 LPXTG 基序,因此以EGDe 菌株溶血素 LLO 为例,通过同源重组技术,将 LLO 的编码基因 hly 在基因组水平进行修饰,形成 ΔLLO 缺失株和 LLOLPXTG突变株,将 LLO 利用形成的LPXTG 基序锚定在李斯特菌的细胞壁上,从而构建一种表面展示系统来呈递抗原并用于免疫学研究。意外的是,试验验证发现构建成功的 LLOLPXTG突变株虽然能够能锚定到细胞表面且溶血活性丧失,但同时也丧失了李斯特菌在细胞内的增殖能力,因此不能持续有效的在体内诱导细胞免疫,也就丧失了它作为呈递抗原产生持续免疫的作用。既然 LLOLPXTG突变株的溶血活性及胞内增殖能力均丧失,那么缺失的第 472-483 位这 12 个氨基酸是哪几个或者哪一个发挥了关键作用呢?我们针对这 12 个氨基酸进行单点及多点突变,构建了多个重组蛋白 LLO突变体,通过溶血活性试验最终发现同时突变了 478 和 479 两个氨基酸的 LLO蛋白(LLON478AV479A)溶血活性丧失。因此我将在上述试验基础上继续展开研究,确定关键位点并进行深入的生物学功能及机制研究。
 
1 材料与方法
 
1.1 菌株及培养条件
本试验研究中所涉及到的菌株为单增李斯特菌野生型菌株 EGD-e、EcoliDH5α、Rosetta 和 LLO 原核表达质粒 pET-30a(+)。所有菌种均来自于 Song’s lab 菌种库。在前期试验基础上已获得重组蛋白LLO、LLON478A、LLOV479A及 LLON478AV479A三个突变体蛋白。单增李斯特 EGD-e 菌株培养于 BHI(BrainHeartInfusion)培养基中,DH5α 和 Rosetta 菌株培养于LB 培养基中,本章节所涉及菌株在培养过程中,其生长条件均在 37℃条件(静置或震荡)培养。
........
 
第三章 单增李斯特菌 CΔhlyN478AV479A感染致病生物学研究..........28
1 材料与方法...........28
1.1 细胞种类及培养条件...........28
1.2 试剂及仪器设备........28
1.3 试验方法.........29
2 试验结果....32
2.1 CΔhlyN478AV479A对宿主细胞造成细胞毒性 .........32
2.2 CΔhlyN478AV479A不影响在巨噬细胞内的增殖效率 ........33
2.3 CΔhlyN478AV479A不显著影响细胞间传播能力 .....35
2.4 CΔhlyN478AV479A不影响细胞间迁移能力 .............36
2.5 CΔhlyN478AV479A对小鼠毒力显著减弱 ......37
2.6 CΔhlyN478AV479A削弱小鼠脏器内增殖能力 .........38
3 讨论............39
第四章 单增李斯特菌依赖 LLO 激活 ERK1/2 及 p38 信号通路.....41
1 材料与方法...........41
1.1 菌株、细胞及培养条件.......41
1.2 试剂及仪器设备........41
1.3 试验方法.........41
1.3.1 细胞感染与总蛋白提取 ...........41
1.3.2 Western blot 分析 MAPK 相关信号分子 .....42
2 试验结果....42
3 讨论............44
 
3 讨论
 
众所周知,细胞内各条信号转导通路虽形成复杂的网络,但每条通路都有它自己的相对独立性,它们能够完成自己所应该传递的信息,产生属于它们自己的生物物学效应。细胞凋亡和自噬是一个十分复杂的过程,具有交错性、多样性,不同应激不同细胞存在不同的信号转导途径,尤其是病原微生物感染诱导或抑制细胞的凋亡和自噬更为错综复杂。MAPK 是一组能被不同的细胞外刺激信号,如病原微生物感染、细胞因子、神经递质、激素、细胞应激及细胞黏附等激活的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。MAPK 通路的基本组成是一种从酵母到人类都保守的三级激酶级联信号传导模式,包括 MAPK 激酶激酶、MAPK 激酶和 MAPK,这三种激酶能依次激活,共同调节细胞的生长、分化、对环境的应激适应、炎症反应等多种重要的生理/病理过程[89]。MAPK 的活性被认为是由活化环的氨基酸序列中的双磷酸化位点所调控。MAPK 活化环中的 TXY 序列是特定的 MKK 催化进行双磷酸化反应的位点。如,对于 ERK/ERK2 来说,双磷酸化位点是 Thr183 和Tyr185,这些位点的双磷酸化使 MAPK 的活性增加千倍以上。MAPK 能被多种炎性刺激所激活,并对炎症的发生、发展起着重要调控作用[61]。本章试验研究了李斯特菌感染 Caco-2 细胞后 MAPK 主要通路的活化情况,研究发现,细菌感染并不影响 ERK1/2、p38 和 c-Jun 三者的总蛋白水平,但能够通过磷酸化 ERK1/2 及 p38 信号传导分子从而激活这两条信号通路。更重要的是,用缺失 LLO 的菌株 Δhly 去感染细胞未能磷酸化 ERK1/2 及 p38。研究首次发现李斯特菌在感染过程中能够依赖关键毒力因子 LLO 上调 ERK1/2 与 p38 的磷酸化水平并激活此信号通路。据报道,病原微生物在感染宿主过程中能够通过合理地选择激活或者抑制 MAPK 信号途径影响炎症反应调控基因的表达。在布鲁氏菌侵染细胞中,粗糙型菌株 RB51 能激活 MAPK 信号通路,而且参与其产生炎症细胞因子 TNF-α 和 IL-1 的是 MAPK 信号通路分支中的 ERK 和 JNK 信号通路[72]。在巨噬细胞中,可溶性葡萄球菌肽聚糖能强烈的激活 ERK 通路。另外,诸多细菌能够通过“操纵”MAPK 通路加强对宿主的感染从而提高致病力。如乳酸杆菌在感染宿主过程中能够通过激活 p38 信号通路协助其感染[73]。分枝杆菌同样能够激活 MAPK 通路进而促进细菌对宿主细胞的黏附和侵袭[74]。相反,耶尔森菌和志贺氏菌在感染时却抑制 MAPK 通路的磷酸化,并下调促炎性反应[75,76]。单增李斯特菌属于典型的胞内寄生菌,在感染时同样能够通过影响宿主信号通路的传导为其在细胞内的感染和生存“铺路”[60]。那么,李斯特菌感染细胞后是如何依赖 LLO 激活 MAPK 主要通路的?其具体的分子机制尚待解析。另外,MAPK 通路活化后对于李斯特菌在宿主内的感染、生存以及应对炎症反应机制有何重要意义?这些科学问题都有待解决。此外,研究李斯特菌感染和炎症发生过程中这些 MAPK 被激活的机制及其生物学效应,对于该病感染的防治及炎症反应的控制有着广泛的应用前景。
\
..........
 
结论
 
1. 首次发现了单增李斯特菌溶血素 LLO 的双重氨基酸突变体蛋白 LLON478AV479A几乎无溶血活性,但能够表达 LLON478AV479A的细菌仍然介导细菌的液泡逃逸,其细胞内生长能力和细胞间扩散效率达到与野生型菌株相似水平,而对小鼠的毒力显著降低。提示 N478 和 V479 两个残基是 LLO 溶血活性所必需的新活性位点,因此对于小鼠中李斯特菌感染至关重要。这种能在细胞内生长但没有溶血活性的低毒力单增李斯特菌株为免疫治疗中活疫苗株的开发提供了新材料。
2. 单增李斯特菌野生株 EGD-e 能够通过磷酸化 ERK1/2 及 p38 信号传导分子激活这两条信号通路。而LLO缺失株Δhly并未检测到磷酸化的ERK1/2及p38,提示单增李斯特菌在感染过程中主要依赖溶血素 LLO 激活 ERK1/2 及 p38 两条信号通路。该研究成果将有助于深入阐明食源性李斯特菌在感染过程中介导宿主 MAPK 激酶信号通路的复杂机制。
..........
参考文献(略)

提供海量毕业论文,论文格式,论文格式范文,留学生论文,商务报告相关资料检索服务。
本论文由代写论文网整理提供 http://www.dxlwwang.com/
需要专业的学术论文资料,请联系我们客服
本文地址:http://www.dxlwwang.com/nongxue/6764.html
论文关键字:农学硕士论文 疫苗载体