第一章 文献综述
中国果树种植已达 0.067 亿公顷，生产果品 900 亿公斤，居世界第一位。陕西是果树种植大省，拥有上千年的种植历史，果树资源丰富，苹果的种植面积、产量、出口量位居全国首位，梨、樱桃、葡萄、猕猴桃种植面积居全国前列（刘得腾 2010）；果树害虫种类多、危害严重，梨小食心虫 Grapholitha moleta 就是其中一种。梨小食心虫主要为害蔷薇科果树的树梢及果实，造成严重的蛀果落果，既影响水果产量和品质，还严重影响果树生长，造成了严重的经济损失（张国辉等 2012a；华自平等 2012）。第一代以幼虫钻蛀桃、李、樱桃的嫩梢，蛀孔流胶并有虫粪，被害嫩梢易折断，以后各代转主蛀食梨、桃、苹果的果实，早期被危害的果实外有虫粪，而晚期入果孔较小，周围青绿色，多无虫粪。幼虫蛀入直达果心，高湿情况下蛀孔周围变黑腐烂，俗称"黑膏药"（万渊等 2010；何淑英等 2011；Myers 2014）。这些危害严重影响我国果树产品的生产和果业的发展。
1.1 梨小食心虫的研究进展
1.1.1 梨小食心虫的发生规律研究
梨小食心虫，又名桃折梢虫，在国内外果树种植区普遍发生。首次发生在日本，20世纪初在澳洲南方发生并传入美国，目前在南美洲、非洲北部和中部地区、亚洲、欧洲、新西兰、北美洲以及澳大利亚等地区均有发生（张国辉等 2012；Riga et al. 2006；Stelinskiet al. 2006）。在我国辽南、华北 1 年发生 3-4 代，中部 4-5 代，南方各省可发生 6-7 代。以老熟幼虫在树皮裂缝、树干基部石缝中结白色的茧越冬。在桃园中以第 1、2 代幼虫危害桃嫩梢，随后各代危害各种蔷薇科果树的果实（赵忠仁 1989）。各代发生期很不整齐，完成 1 代约需 30-40 天，世代重叠严重。成虫白天多静伏在树叶、枝和杂草丛中，黄昏后开始活动，成虫夜间产卵，单粒散产。对糖醋液、果汁及黑光灯有较强的趋性。对梨小食心虫在不同地区不同果园的发生规律研究报道很多，目前已经明确了其在 15个省 32 个地区的发生状况，具体见表 1.1 （杨小凡 2013）。昆虫的生长发育、繁殖及种群动态变化会受到如环境、寄主（种类、聚集度、生长状况等）、天敌、人等多种因素单独或共同的影响。梨小食心虫初孵幼虫对强风、降雨和强光等非生物因素敏感度极高。幼虫间竞争嫩梢或果实，存活率随拥挤度的升高而降低。幼虫一旦蛀入寄主，就很少受自然天敌和温度的影响（Rothschild & Vickers 1991）。老龄幼虫脱果结茧时，会暴露在果实外部环境中，易受其它因素的影响，死亡率上升（Brunson & Allen 1948）。温、湿度会极大的影响梨小食心虫的存活。研究表明梨小食心虫卵、幼虫、蛹及全世代的发育起点温度和有效积温分别是10.39℃和59.84℃/d、9.95℃和200.43℃/d、10.97℃和140.82℃/d、9.80℃和448.08℃/d（李文亮等 2010）。
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1.2 昆虫中肠蛋白酶的研究进展
昆虫的中肠，可分泌消化酶，是一个极其复杂的消化食物和吸收营养的场所；解剖结构上由内向外是围食膜、细胞层、底膜、环肌和纵肌、围膜。部分昆虫中肠的肠壁向外突出形成胃盲囊，其位置和数目常不等，用以增加中肠的分泌和吸收面积。在昆虫中肠内，昆虫所摄取的食物在各种蛋白酶的共同作用下被消化，释放营养物质（王萍等2011；陈文波和李卫国 2013）。在昆虫的中肠中含有多种蛋白酶，作用于肽键使其断裂为容易吸收的多肽分子，所以昆虫中肠内蛋白酶的种类、活性及比例对昆虫营养的获得、生长发育、迁徙、交配、繁殖等生命活动具有极其重要的作用（Li et al. 2004）。根据蛋白酶活性中心的不同，又可分为丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、巯基蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶等，其中丝氨酸蛋白酶占主要地位（Oppert et al. 1999）。昆虫丝氨酸蛋白酶家族（serine proteinases, SPs）是重要的蛋白消化酶，主要包括胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，约占总消化酶活性的 95％(Srinivasan et a1. 2006)。此外，还有羧肽酶、氨肽酶、组织蛋白酶 B、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、凝血酶、纤溶酶、蚓激酶等（Jiang& Kanost 2000）等。蛋白酶功能主要分两个方面：一是消化蛋白质食物，二是激活酶原（胰腺分泌）（Ishaaya et al. 1971；Purcell et al. 1992）。蛋白酶活性在鳞翅目昆虫幼虫中肠内的蛋白水解过程中发挥极为重要的作用（Wolfson & Murdock 1990；Oppert et al. 1999），已有很多关于鳞翅目昆虫蛋白酶活性的报道，且发现鳞翅目不同昆虫的蛋白酶活性存在差异（Ahmad et al. 1980；Eguchi & Kuryama 1985；Houseman et al.1989；Christeller et al. 1992）。此外，昆虫肠道中同一种消化酶具有多种异构体的形式，如在棉铃虫不同时期的肠道中丝氨酸蛋白酶就有 20 多种（Bown et a1. 1997；Gatehouse eta1. 1997；Patankar et a1. 2001），研究表明多种异构体同时存在对昆虫的消化影响不大，但在忍耐食物中的毒素和蛋白抑制剂等方面起着重要作用。因此，对昆虫肠道中蛋白消化酶的活性研究对于了解其消化功能极其重要。丝氨酸蛋白酶作为一类重要的水解酶，参与多了种生理生化的过程，包括食物蛋白的消化，血液凝固，免疫反应，信号转导和激素活化（Barrett et a1. 2003），另外在胚胎发育、组织重建、细胞分化和血管形成过程中也发挥着重要作用（Maxwell & Enrico 2001）。因此丝氨酸蛋白酶具有广泛的研究和应用价值，目前人们对其结构、功能及重组表达的研究已经很深入，并且已经有不少种类的丝氨酸蛋白酶被应用到医药等领域。
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第二章 实验材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 供试昆虫
室内饲养：采用西北农林科技大学植物保护学院害虫综合防治研究室人工饲养多代的梨小食心虫。饲养条件参照杜娟（2014）的方法：温度 26±0.5℃，相对湿度 70%±10 %，光周期 15L∶9D，光照强度 4800 lx 的 ZPQ-280B 型人工气候箱。田间采集：在陕西省咸阳市西北农林科技大学园艺站、乾县及安康白河县果园采集梨小食心虫。
2.1.2 实验试剂
0.15mol/L 氯化钠、2-D Quant Kit 试剂盒、AZOCASEIN（氨苯磺胺偶氮酪蛋白），TAME（Nα-p-甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯）、N-苯甲酰基-L-酪氨酸乙酯（BTEE）、二甲基亚砜（DMSO）、BAPNA（Nɑ-苯甲酰-DL-精氨酸-p-硝基苯胺）均购自 Sigma 公司；Tris、HCl、Glycine、KH2PO4、Trizol 提取液、异戊醇、氯仿、琼脂糖、消化试剂盒、RevertAidFirst Strand cDNASynthesis kit 反转录试剂盒和 2×LAMP MasterMix 酶均购自康伟世纪生物公司；Universal DNA Purification Kit 通用型 DNA 纯化回收试剂盒、菌种及质粒:pMD19-T Vector 载体、大肠杆菌 E.coli DH5ɑCompetent Cells、总 RNA 提取试剂购自科恩公司；荧光定量反转录试剂盒、荧光定量试剂盒 RNase H 和 DNA 纯化试剂盒均购自TAKARA 生物试剂公司。
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2.2 寄主对梨小食心虫幼虫中肠胰蛋白酶活性的影响
田间采集：从田间桃梢（青烟一号，陕西省咸阳市乾县桃园）、梨（砀山酥梨，陕西省咸阳市西北农林科技大学园艺站梨园）、木瓜（白河木瓜，陕西省白河县）、苹果（秦冠，陕西省咸阳市西北农林科技大学园艺站苹果园）4 种寄主植物上分别采集 3 龄、4龄和 5 龄梨小食心虫幼虫。人工饲养：采用人工饲料饲养多代的梨小食心虫，饲养参照杜娟（2014）的方法。参照 Du 等（2015）的方法：将新鲜果实（大小一致，苹果（秦冠）、苹果（嘎啦）、海棠（木瓜海棠）、毛桃（青烟一号）、油桃（中油 6 油桃）、李（红布林李子））清洗消毒，放入塑料盒（已消毒）内。人工饲料饲养的梨小食心虫产卵，从卵期开始分别饲喂上述6 种寄主果实，每隔一天解剖果实，收集 3、4 和 5 龄梨小食心虫幼虫。对照人是用工饲料饲养的梨小食心虫饲喂人工饲料，收集 3、4 和 5 龄梨小食心虫幼虫。共 11 个处理，每处理重复 3 次。
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第三章 结果与分析.....25
3.1 梨小食心虫幼虫中肠胰蛋白酶最适 pH 测定结果 ......... 25
3.2 寄主植物对不同龄期梨小食心虫幼虫中肠胰蛋白酶活性的影响 .... 26
3.3 寄主植物对梨小食心虫生长发育的影响 .... 29
3.4 梨小食心虫胰蛋白酶基因克隆 .......... 32
3.5 取食不同寄主梨小食心虫幼虫中肠胰蛋白酶基因表达量 ...... 38
3.5.1 引物的特异性和扩增效率 .......... 38
3.5.2 取食不同寄主的不同龄期梨小食心虫的胰蛋白酶基因表达量 .......... 39
第四章 结论.......43
第五章 讨论.......44
5.1 梨小食心虫幼虫中肠胰蛋白酶最适 pH ...... 44
5.2 寄主植物对梨小食心虫幼虫中肠胰蛋白酶活性影响 .... 44
5.3 寄主植物对梨小食心虫生长发育的影响 .... 45
5.4 寄主植物对梨小食心虫幼虫胰蛋白酶基因表达量的影响 ...... 46
5.5 梨小食心虫蛋白酶活性与其生长发育的关系 ...... 46
5.6 梨小食心虫蛋白酶活性与幼虫中肠胰蛋白酶基因表达的关系 ........ 47
5.7 梨小食心虫生长发育与幼虫中肠胰蛋白酶基因表达的关系 ............ 47
5.8 梨小食心虫胰蛋白酶活性、生长发育与幼虫.......... 47
第五章 讨论
5.1 梨小食心虫幼虫中肠胰蛋白酶最适 pH
目前关于鳞翅目昆虫蛋白酶活性的研究较多。昆虫中肠内的 pH 值对蛋白消化酶活性的影响很大。由于昆虫生存的环境、寄主及其个体间存在的差异引起中肠 pH 值的不同，从而导致蛋白酶活性存在较大差异（Berenbaum 1980; Broadway & Duffey 1986b;Schultz & Lechowicz 1986）。粉纹夜蛾的胰蛋白酶的最适 pH 值分别为 8.5，而菜粉蝶的为 8.0（Broadway 1989）。本研究发现，梨小食心虫幼虫中肠总蛋白酶在 Tris-HCl、KH2PO4/NaOH 和 Glycine/NaOH 3 种缓冲液中最适 pH 分别为 10.5、11.0 和 11.0，强碱性胰蛋白酶在 3 种缓冲液中的最适 pH 分别为 10.5、11.0 和 11.0；弱碱性胰蛋白酶在 3种缓冲液中的最适 pH 分别为 8.5、9.0 和 9.0。总蛋白酶活性在 pH 6.0~8.5 范围内变化不明显，而在 pH>8.5 后，上升趋势显著。在不同缓冲液和 pH 条件下，强碱性胰蛋白酶与总蛋白酶的活性变化相似，其最适 pH 值比较接近总蛋白酶的最适 pH 值，二者都需要强碱性环境，可推断在梨小食心虫幼虫中肠消化道内，强碱性胰蛋白酶是一种极其重要的消化蛋白酶，在 Tris-HCl 缓冲液和 KH2PO4/NaOH 缓冲液 pH11.0 时，酶活性下降，可能是由于蛋白酶活性在 pH11.0 处不稳定。而弱碱性胰蛋白酶只有在弱碱性的环境，酶活性较高。
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结论
梨小食心虫幼虫中肠蛋白酶活性和胰蛋白酶基因表达量均表现为 4 龄>3 龄>5 龄。从田间寄主梨上采集梨小食心虫的 2 个基因表达量和蛋白酶活性较高，二者成正相关。室内人工饲养梨小食心虫取食苹果（嘎啦）的总蛋白酶和强碱性胰蛋白酶活性均较低，而基因 GMtrypsin-1 表达量较高，其基因表达量与蛋白酶活性成负相关或相关性不高。室内人工饲养的梨小食心虫，取食苹果（秦冠）的总蛋白酶和强碱性胰蛋白酶活性均高于取食苹果（嘎啦），而 2 个基因的表达量均低于后者，其基因表达量与蛋白酶活性成负相关或相关性不高。寄主苹果（秦冠）上采集的梨小食心虫总蛋白酶和强碱性胰蛋白酶活性和 GMtrypsin-2 表达量小于人工饲养的梨小食心虫取食苹果（秦冠），而GMtrypsin-1 表达量高于后者，其蛋白酶活性与 GMtrypsin-2 基因表达量成正相关，但与GMtrypsin-1 表达量基因表达量成负相关或相关性不高。胰蛋白酶基因相对表达量高但胰蛋白酶活性不一定高，可能由于中肠环境内其它因素抑制其发挥活性；胰蛋白酶活性高但基因相对表达量不一定高，可能由于胰蛋白酶是一个多基因家族，胰蛋白酶活性与其他胰蛋白酶基因的表达相关，二者之间的关系还需进一步的研究。
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参考文献（略）
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