猪源益生菌分离鉴定及农学复合物筛选

添加时间：2018-06-21 19:28:15 浏览:次作者：

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本文是一篇农学硕士论文，农业硕士专业学位侧重于应用，包括农艺与种业、资源利用与植物保护、畜牧、渔业发展、食品加工与安全、农业工程与信息技术、农业管理、农村发展八个领域，主要为农业技术应用、开发及推广，农村发展，农业教育等企事业单位和管理部门培养具有综合职业技能的应用型、复合型高层次人才。（以上内容来自百度百科）今天为大家推荐一篇农学硕士论文，供大家参考。

第 1 章文献综述

20 世纪中期以来，畜禽养殖发展过程中，饲用抗生素在提高饲料利用率、减少疾病发生等方面均起到了一定的积极作用[1]。但随其广泛使用，对畜禽业发展、生态环境及人体健康产生的危害逐步被认识，寻找绿色无公害饲料添加剂已成为畜禽业迫切需要解决的问题[2]。目前常用的饲用添加剂有化学制剂、酸化剂、益生素、酶制剂、中草药、植物提取物等物质，其中益生菌等抗生素替代物具有促进动物肠道优势菌的形成、提高动物的饲料利用率和抗免疫病力等作用，且未见二次污染的报道，其优势受到广泛关注[3,4]。如张荣标[5]研究表明饲喂大豆皂苷使大鼠巨噬细胞提高 55.3%，吞噬指数提高 62.8%。张锦华[6]研究发现唾液乳杆菌可显著增加仔猪小肠益生菌数量（P﹤0.05）和分泌细胞数量（P﹤0.05），且促进仔猪日增重（P﹤0.05）和小肠绒毛生长（P﹤0.05）。当前益生菌饲用添加剂的研发焦点已从单一菌种益生菌产品研发转换到益生菌复合物的开发利用。皂苷，又称碱皂体、皂素、皂甙、皂角苷、皂草苷，属于螺旋甾烷类化合物的一类糖苷，主要分布于陆地高等植物中，少量存在于海洋生物中。皂苷均具有提高机体免疫作用[11]。潘龙[12]等报道柴胡皂苷能提高胃肠道乙酸和 VFA 含量，可促进肠道益生菌的生长繁殖，同时抑制大肠杆菌及沙门氏菌的生长繁殖。杨秀伟[13]研究了人肠内细菌对罗汉果皂苷Ⅲ的影响，表明罗汉果皂苷Ⅲ在肠内细菌作用下，转化为更易被消化吸收的质量分子更小的代谢物。综上所述，研究资料表明益生菌和皂苷具有良好的饲用添加剂功能，且具有低毒低残优点，作为替代抗生素被广泛研究。但有关大豆皂苷对猪源益生菌生长繁殖的作用及二者联合应用效果研究未见报道。

1.1 益生菌在畜禽业应用现状

益生菌既可定植于宿主肠道，调节宿主肠道内微生态平衡；又可通过刺激肠道免疫和消化系统，促使宿主发挥其免疫和消化机能[14,15]。虽然益生菌具有提高机体免疫功能和生产性能作用，但目前在临床生产应用中仍未达到预期目的。来自非宿主胃肠道益生菌（例如，土壤、水源、植物）在特定动物胃肠道的定居繁殖方面受制约，宿主体内的益生菌数量不足，很难发挥作用，而同源益生菌极易适应宿主胃肠道环境条件，在一定程度上可克服上述缺点。当前益生菌临床应用表明，无论是单一菌种的制剂，还是多菌种制剂，同源益生菌比非同源益生菌作用效果明显，开发同源复合益生菌制剂成为当前饲用益生菌添加剂的研发方向之一[16]。

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1.2 大豆皂苷在畜禽业应用现状

1.2.1 大豆皂苷概述

大豆皂苷（postseasons，SS）是存在于大豆胚轴中，具有抗癌、抗突变、毒副作用小的一种活性物质[33,34]。因其具有增强免疫力、抗肿瘤、抗凝血、抗血栓等作用，其开发利用受到广泛关注[43-47]。

1.2.2 大豆皂苷的作用

1.2.2.1 增强免疫调节功能作用

研究表明，大豆皂苷可促进 T 细胞增长及 IL-2 分泌，T 细胞增加促进了 IL-2分泌；白介素分泌量提高后，促使 T 细胞生成淋巴因子，淋巴因子激活杀伤性细胞，从而提高机体免疫力[48-49]。朱孝娟等给 60 只 SPF 小鼠接种 7d S180 肉瘤细胞，试验组按不同剂量饲喂大豆皂苷制剂，连续灌胃 15d，结果显示大豆皂苷可明显增强注射肉瘤细胞小鼠的免疫力，但其作用效果不随大豆皂苷剂量的增加而持续增强[50]。

1.2.2.2 促进益生菌生长繁殖作用

皂苷具有调节动物机体胃肠道内环境、促进有益菌生长繁殖等作用。潘龙等[12]通过观察柴胡皂苷对发酵液菌群含量变化，发现柴胡皂苷提高了胃肠道中乙酸和 VFA 的含量，有益菌数量增加，同时，也抑制了大肠杆菌及沙门氏菌有害菌的繁殖。

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第 2 章猪源益生菌的分离鉴定

畜禽养殖生产中滥用抗生素给畜禽产品安全和生态环境带来负面影响，如环境污染和耐药性问题，随着生活水平的提高和保健意识的增强，政府和社会对畜产品安全生产越来越重视，寻求绿色无公害饲用添加剂已成为饲料添加剂开发研究的焦点。益生菌具有促进畜禽胃肠道形成优势菌群，提高畜禽的饲料利用率和抗病力等作用，受到广泛关注。筛选优良的益生菌菌株，对研发高效益生菌制剂有重要意义。传统的鉴定细菌方法准确性不高，随着 16Sr DNA 序列分析法在细菌菌株鉴定的应用，同源益生菌的分离研究逐步增多[61]。如赵述淼[62]采用分子生物学方法从健康猪肠道中分离鉴定 1 株芽孢杆菌，并测定芽孢杆菌的生长特性。本试验从猪肠道内容物分离益生菌，为益生菌制剂研发提供种资源。

2.1 材料与方法

2.1.1 材料

2.1.1.1 试验动物

随机选择山区规模化养殖场的健康猪，猪群生长周期内饲喂中草药和益生菌发酵饲料，未投喂抗生素。益生菌复合物为自配，菌种是从种植中药的土壤中分离获得。

2.1.1.2 培养基

MRS（MRSAgar Base）培养基和 MRS（MRSAgar Base）液体培养基，购于青岛高科园海博生物技术有限公司。

2.1.1.3 主要试剂

微量生化发酵管购于北京索莱宝试剂有限公司，其种类见表 2-1。碳酸钙、Clonal、革兰氏染液、PBS 缓冲液（PH=7.2）、TAE 、琼脂糖。

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2.2 结果与分析

2.2.1 待检菌株的培养性状及形态学特征

从猪肠道分离 8 株益生菌，其中 3 株为鼠李糖乳杆菌，2 株为布氏乳杆菌，1 株为植物乳杆菌，1 株为枯草芽孢杆菌，1 株为弯曲乳杆菌。分离菌株的培养性状及形态学观察结果见表 2-3。7 株菌的微量生化反应结果为硝酸盐还原阴性、葡萄糖产气阴性、过氧化氢酶阴性、明胶液化阴性、硫化氢阴性、15℃和 45℃均生长、不运动。参照《伯杰氏细菌鉴定手册》，确定为乳酸菌（RG-1、RG-3、RG-5、RG-6、RG-7、RG-10、RG-11）。1 株菌的微量生化反应结果为过氧化氢酶阳性、明胶液化阳性、硝酸盐还原阳性、硫化氢阴性。参照《伯杰氏细菌鉴定手册》确定为芽孢杆菌属(YB-8)。

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第 3 章抗逆性益生菌菌株的筛选....12

3.1 材料与方法.......13

3.2 结果与分析.......14

3.3 讨论.........16

3.4 小结.........16

第 4 章大豆皂苷与复合益生菌联合应用效果观察..... 18

4.1 材料与方法.......18

4.2 结果与分析.......20

4.3 讨论.........23

4.4 小结.........24

第 5 章益生菌复合物对大鼠肠道菌群及免疫器官指数影响......... 25

5.1 材料与方法.......25

5.2 结果与分析.......27

5.3 讨论.........28

5.4 小结.........29

第 5 章益生菌复合物对大鼠肠道菌群及器官免疫指数影响

益生菌具有调节宿主肠道菌群，增强免疫力等功能，又无二次污染，开发益生菌添加剂对畜禽业持续发展具有重要意义。由于受动物胃肠及产品贮藏环境条件等多种因素影响，益生菌未能充分发挥其作用效果[80,81]，因此从不同角度评价复合益生菌制剂应用效果对其新产品的开发，具有重要意义。本文对 30 只 SD大鼠进行饲喂试验，通过检测不同浓度大豆皂苷与复合益生菌复合物对大鼠平均日增重、平均日采食量、饲料转化率、肠道大肠杆菌、乳酸菌变化及器官免疫指数的影响，筛选效果明显的复合益生制剂配方，现报道如下。

5.1 材料与方法

从河北医科大学购 1 日龄健康 SD 大鼠 30 只，随机将 30 只大鼠分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ5 个组，每组 6 只。笼养，室温 22±2℃，相对湿度 55±5%。试验过程采取自由采食饮水方法。从第 40d 开始，每天对Ⅰ组灌服 0.5mL 生理盐水，Ⅱ组灌服 0.5mL 市售益生菌，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ3 个组一次性灌服益生菌复合物，灌服剂量如表 5-1。整个试验过程中，观察大鼠健康状况，是否出现腹泻、出血、死亡现象，记录大鼠的采食量。复合物对大鼠平均日增重、平均日采食量、饲料转化率影响，如表 5-4 所示，Ⅳ组(0.5mL 益生菌复合物)、Ⅴ组（0.8mL 益生菌复合物）采食量最低，明显低于对照组，差异极显著(P<0.01)，Ⅲ组（0.2mL 益生菌复合物) 低于照组，差异显著(P<0.05)。尽管各组大鼠平均日增重差异不显著，但是添加益生菌大鼠日增重有增加的趋势。这些结果说明，添加益生菌复合物可以提高大鼠饲料转化率，降低采食量，但对大鼠体重无明显影响(P>0.05)。