医药学发表：半乳糖凝集素-9在食管鳞状细胞癌中的表达及其与临床病理特征的关系

半乳糖凝集素(galectins)是在生物体内存在的一类结合蛋白质,其参与了多种生理和病理过程,如细胞黏附､细胞凋亡､细胞增殖､炎症反应和免疫调节等｡半乳糖凝集素家族目前已发现并确认的有15个成员｡近年来研究证实,半乳糖凝集素与肿瘤的发生､发展及不良预后有着明确的关系,目前研究主要集中于其家族成员galectin-1和galectin-3,有关galectin-9的研究甚少｡本研究采用免疫组化法检测食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cellcancer,ESCC)组织中galectin-9的表达情况,并观察其对ESCC细胞侵袭及迁移的影响,阐明其在ESCC发生､发展中可能的作用机制,为肿瘤的基因预防和靶向治疗提供新的实验依据｡

1资料与方法

1.1标本来源
按照国际抗癌联盟(UICC)标准进行TNM分期:Ⅰ期+Ⅱa期45例､Ⅱb+Ⅲ期44例;其中有淋巴结转移38例｡收集山东大学附属济南市中心医院胸外科于2012年1月至2013年1月手术切除的ESCC患者新鲜组织标本89例及距癌组织边缘5 cm以上的癌旁组织标本20例｡其中男性61例,女性28例,平均年龄(63.75±2.10)岁｡所有患者术前均未接受放､化疗,全部病理切片均经过2名高年资病理医师复阅证实｡所有标本的获取均取得受试者或其家属的知情同意并签署知情同意书,均经医院伦理委员会批准｡

1.2细胞株､主要试剂和仪器
食管癌EC9706细胞系购自中国科学院上海细胞研究所细胞库,在含10%胎牛血清(FBS)的RMPI1640培养基及37℃､5%CO 2条件下培养｡每天观察细胞生长情况,2 d更换一次培养液,当细胞铺至培养瓶的80%~90%进行传代,传代比例约为1∶3,以后每隔2~3 d进行一次传代｡
鼠抗人galectin-9单克隆抗体､羊抗鼠IgG单克隆抗体均购于Santa Cru公司,胎牛血清及RMPI1640培养基购自美国Gibco公司,免疫组化染色超敏试剂盒(S-P法)和DAB显色试剂盒均购自北京中山生物公司,包含galectin-9编码区的pcDNA3.1-galectin-9重组质粒及空载体pcDNA3.1由上海生工生物工程技术服务公司构建和提供,Lipofectamine TM2000购自Invitrogen公司,Transwell小室购自康宁公司,基质胶购自美国BD公司｡

1.3免疫组织化学法检测ESCC患者组织及癌旁组织中galectin-9蛋白的表达
常规石蜡包埋的组织制成5μm的连续切片,染色过程按试剂盒操作手册进行,抗体稀释至1∶100,PBS代替一抗作阴性对照｡DAB显色剂染色,Mayer苏木精复染,中性树胶封固｡每张切片至少观察5个视野,每个高倍视野至少观察100个细胞,结果判定:(1)阳性细胞数:以胞质或者胞核出现黄染为阳性,计算阳性细胞平均百分率,无阳性细胞为0分,<25%为1分,25%~75%为2分,>75%为3分;(2)染色阳性强度:无着色为0分,淡黄色为1分,黄色或深黄色为2分,褐色或深褐色为3分;将(1)和(2)两项的评分相乘,其积≥1为阳性｡

1.4重组质粒与载体质粒转染EC9706细胞
按照Lipofectamine TM 2000试剂说明书转染重组质粒pcDNA3.1-galectin-9及空载体质粒pcDNA3.1于EC9706细胞,分别作为EC9706-galectin-9转染组(pcDNA3.1-galectin-9)和EC9706-pcDNA3.1阴性对照组(Negative-control),同时设置未进行转染操作的空白对照组EC9706细胞(Blank-control)｡在转染48 h后,收集各组细胞备用｡

1.5 Western blotting检测转染后EC9706细胞galectin-9蛋白的表达
收集指数生长期细胞,加入配置预冷的RIPA裂解液,充分匀浆裂解提取总蛋白,BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白样品浓度｡每组取50μg蛋白上样,SDS-Page电泳,50μg/L脱脂牛奶室温封闭1 h,加入适当浓度一抗,4℃过夜,次日洗膜后加入HRP标记的二抗,室温孵育1 h,洗膜后,将膜置于ECL中,于凝胶成像系统中曝光并采集图像,以GADPH的表达作为参照,应用Image J软件进行分析,以galectin-9条带密度值与GADPH条带密度值的比值表示galectin-9蛋白的相对表达｡实验重复3次｡

1.6划痕实验检测EC9706细胞的迁移
取对数生长期的pcDNA3.1-galectin-9组､阴性对照组和空白对照组EC9706细胞,分别以2×10 5个/孔的细胞密度接种于6孔板中,待各组细胞汇合度达到90%后,用200μl的黄色枪头在垂直培养皿底面上沿直线进行“一”字形轻轻划痕,PBS冲洗2次后继续培养,24 h后在倒置显微镜下观察细胞划痕愈合情况,以细胞划痕愈合百分比表示细胞的迁移能力｡划痕愈合率(%)=[(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度]×100%｡

1.7 Transwell法检测EC9706细胞的侵袭
实验前将所有细胞重悬于无血清培基中进行饥饿处理,Matrigel基质胶包被Transwell小室基底膜,待基质胶凝固后,向小室的上孔每孔加入5×10 4个细胞的细胞悬液,下层加入含10%FBS的培养基,置于37℃孵箱中培养,24 h后取出transwell小室,吸去上层多余液体,PBS清洗两次,棉签拭去上层小室内未迁移的细胞,4%多聚甲醛固定,结晶紫染色,光镜下分别随机选取5个视野的穿膜细胞,计算平均数｡实验重复3次｡

1.8统计学处理
应用SPSS 20.0统计软件,计量资料以珋x±s表示,多组数据间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用独立样本t检验,阳性率的比较采用χ2检验,以P<0.05或P<0.01表示差异有统计学意义｡

2结果

2.1 ESCC组织中galectin-9蛋白的表达明显低于癌旁组织
免疫组化检测结果(图1)显示,ESCC患者组织中galectin-9蛋白的阳性表达率明显低于癌旁组织[25.8%(23/89)vs 50%(10/20),P<0.05]｡探讨半乳糖凝集素-9(galectin-9)在食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell cancer,ESCC)组织及癌旁组织中的表达及对ESCC细胞迁移和侵袭能力的影响｡
手术切除的ESCC患者组织标本89例及距癌组织边缘5 cm以上的癌旁组织标本20例,采用免疫组化法检测ES-CC及癌旁组织中galectin-9蛋白的表达,并分析其与患者性别､年龄､浸润深度､肿瘤大小､分化程度､病理分期(pTNM)及淋巴结转移等临床病理特征之间的关系｡采用脂质体介导法将pcDNA3.1-galectin-9转染食管癌EC9706细胞系,运用细胞划痕愈合实验和Transwell侵袭实验,检测galectin-9表达上调对食管癌EC9706细胞迁移､侵袭能力的影响｡
ESCC组织中ga-lectin-9蛋白的阳性表达率明显低于癌旁组织[25.8%(23/89)vs 50%(10/20),P<0.05],galectin-9蛋白的表达与ESCC患者肿瘤分化程度及淋巴结转移相关(均P<0.05),而与患者性别､年龄､肿瘤大小､浸润深度及病理分期无关(均P>0.05)｡在食管癌EC9706细胞中过表达galectin-9后,与阴性对照组相比,肿瘤细胞的侵袭[(45.0±8.0)vs(160.0±12.0),P<0.01]和迁移能力[(20.6±2.1)vs(87.6±4.9),P<0.05]明显下降｡
galectin-9的表达缺失参与了食管癌的发生､发展,ga-lectin-9可以抑制ESCC细胞的侵袭及迁移｡

2.2 Galectin-9蛋白表达与ESCC患者临床病理特征间的关系
统计学分析(表1)显示,galectin-9蛋白表达与ESCC患者肿瘤浸润深度及淋巴结转移密切相关(均P<0.05),而与年龄､性别､肿瘤大小､病理分期(pTMN)无关(均P>0.05)｡

2.3 pcDNA3.1-galectin-9转染对各实验组EC9706细胞galectin-9蛋白表达的影响
Western blotting检测结果显示,与Nega-tive-control组及Blank-control组相比,pcDNA3.1-ga-lectin-9转染组galectin-9蛋白的相对表达量明显上升[(0.31±0.11)vs(0.11±0.04)､(0.08±0.03),均P<0.05]｡Negative-control组与Blank-control组差异无统计学意义(P>0.05)｡

2.4转染pcDNA3.1-galectin-9抑制EC9706细胞的迁移
细胞划痕损伤实验结果显示,与Blank-control组和Negative-control组相比,转染pcDNA3.1-galectin-9后,pcDNA3.1-galectin-9转染组细胞划痕愈合百分率明显降低为[(20.6±2.1)%vs(84.1±5.1)%､(87.6±4.9)%,均P<0.01];而Blank-control组和Negative-control组细胞划痕愈合百率差异无统计学意义(P>0.05)｡结果说明,pcDNA3.1-galectin-9转染明显抑制EC9706细胞的迁移｡

2.5转染pcDNA3.1-galectin-9抑制EC9706细胞的侵袭
Transwell检测结果(图4)显示,Blank-control组和Negative-control组的细胞穿膜数量分别为(145±10)个/HP和(160±12)个/HP,pcDNA3.1-galectin-9组的细胞穿膜数为(45±8)个/HP,明显少于前两组(均P<0.01),前两组间细胞穿膜数差异无统计学意义(P>0.05)｡结果表明,转染EC9706-galec-tin-9后可有效降低EC9706细胞的侵袭能力｡

3讨论

既往的研究表明,ga-lectin-9的表达下调在多种恶性肿瘤发生中起着重要的作用｡Galectin-9属半乳糖凝集素家族中的一员,1977年Wada等在鼠胚肾组织中首次分离得到,随后,在结节性硬化型霍奇金淋巴瘤肿瘤组织中克隆出galectin-9并被首次命名｡有研究发现良性黑色素痣组织ga-lectin-9 mRNA高表达,而其在恶性黑色素瘤组织中galectin-9 mRNA表达明显下降｡Liang等研究发现,子宫颈正常鳞状上皮组织､低度上皮内瘤变､高度上皮内瘤变及宫颈鳞癌组织中galectin-9的表达水平逐渐下降｡近年来研究已经表明,galectin-9表达的降低与多种恶性肿瘤的进展转移具有明显的相关性,在乳腺癌和恶性黑色素瘤患者中,galectin-9表达缺失的患者更容易出现肿瘤转移,在肝癌与宫颈鳞癌组织中,galectin-9的表达程度与恶性程度呈明显的负相关,但是目前有关ESCC组织中galectin-9表达情况的研究甚少｡
本实验发现,在ESCC组织中galectin-9蛋白的表达明显较正常的食管鳞状上皮组织降低,并且低分化ESCC组织galec-tin-9蛋白的表达明显较中高分化的ESCC组织降低,有淋巴转移的ESCC组织galectin-9蛋白的表达明显较无淋巴转移的ESCC组织降低,实验结果说明在ESCC的发生､发展过程中galectin-9蛋白的表达缺失起着一定的作用｡
恶性肿瘤的局部浸润和远处转移是目前肿瘤治疗的难点,也是影响肿瘤患者生存期最重要的原因｡近年来肿瘤细胞学研究发现,galectin-9影响多种肿瘤细胞的增殖､迁移和侵袭等细胞生物学行为,起到一定的抗肿瘤作用｡本研究通过划痕愈合及Transwell小室侵袭实验进一步证实,食管癌EC9706细胞转染galectin-9表达上调后,细胞的迁移､侵袭能力明显下降,提示galectin-9可以降低食管癌EC9706细胞的迁移､侵袭能力,与galectin-9在其他肿瘤细胞中的研究结果一致｡
T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3(T-cell immunoglob-ulin mucin-3,Tim-3)是Galectin-9的受体,与Galec-tin-9结合后发挥着免疫调节的作用｡Galectin-9/Tim-3途径目前在过敏性疾病､自身免疫性疾病和炎症性疾病中的作用已经得到证实,但在恶性肿瘤中研究较少｡Gehring等报道,Galectin-9/Tim-3途径可以通过调节MDSCs(促进髓源抑制细胞)的扩张从而影响肿瘤生长｡Li等发现,Galectin-9/Tim-3与HBV相关性肝细胞癌的发生､发展及预后相关,但Jiang等的研究则发现,Galectin-9在胃癌发生､发展中的机制并非通过Galectin-9/Tim-3途径来实现的｡Galectin-9对食管癌发生､发展影响的具体分子机制及与Galectin-9/Tim-3途径的关系尚需在今后的试验中进一步证实｡
综上,galectin-9的表达缺失在ESCC的发生､发展过程中起着重要作用,对肿瘤的侵袭､迁移产生一定的影响,galectin-9可能成为治疗食管癌的新的靶点,为食管癌的治疗提供新途径｡

[参考文献](略)